在PCR产物纯化中,蛋白酶K 的作用是什么,以及其原理 感激不尽啊!这个与上面的问题不知道有没有关系,之前看到一个说,可用EDTA代替蛋白酶K ,不知道这个和我的问题有没有联系,如果有联系,

在PCR产物纯化中,蛋白酶K 的作用是什么,以及其原理 感激不尽啊!这个与上面的问题不知道有没有关系,之前看到一个说,可用EDTA代替蛋白酶K ,不知道这个和我的问题有没有联系,如果有联系,
在PCR产物纯化中,蛋白酶K 的作用是什么,以及其原理 感激不尽啊!
这个与上面的问题不知道有没有关系,之前看到一个说,可用EDTA代替蛋白酶K ,不知道这个和我的问题有没有联系,如果有联系,

在PCR产物纯化中,蛋白酶K 的作用是什么,以及其原理 感激不尽啊!这个与上面的问题不知道有没有关系,之前看到一个说,可用EDTA代替蛋白酶K ,不知道这个和我的问题有没有联系,如果有联系,
觉得应该是灭活Taq酶的,这个原理应该是比较清楚的,不赘述了.
用EDTA的话,EDTA是广谱的螯合剂,可以和金属离子结合.在配制PCR的反应物时都会加入镁盐,因为镁是Taq所必须的,EDTA掠夺镁离子,也可以起到灭活Taq酶的作用.

蛋白酶K就是水解蛋白质，去除DNA样品中蛋白质的。

蛋白酶K
由真菌Tritirachium album Limber产生的蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶...

全部展开

蛋白酶K
由真菌Tritirachium album Limber产生的蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。
推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。 　
蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。据资料显示：该酶有两个ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶k消化过程中通常加入edta（以抑制依赖于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l ca2+而不含edta的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至终浓度为2mmol/l,以鳌合ca2+。
　　蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广的pH范围内（pH 4-12.5）均有活性。
　　推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
　　蛋白酶K配制标准：20mg/ml蛋白酶K配制标准（proteinase K）：将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。
蛋白酶k的作用
　　值得注意的是，蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效蛋白酶k的保存
　　保存：保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。
　　孵育温度为55至65℃，理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48小时；理想孵育时间为2小时。
广泛应用
　　蛋白酶K已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用弹性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。
希望这些资料能对你有帮助~

收起

PCR 产物纯化应该不需要蛋白酶K，因为PCR产物中没有太多的蛋白杂质。
EDTA是防止PCR产物被聚合酶水解。
EDTA需要，蛋白酶K不需要。